О бреттах (Brettanomyces)

В последние годы дрожжи рода Brettanomyces вызывают все больший интерес у производителей пива. Существует масса уникальных пивных стилей и сортов (например belgian ale, Flanders red ale, oud bruin, sour/wild ale, lambic, gueuze, saison, и т.д.) которые обладают ярко выражжеными вкусовыми и ароматическими особенностями, во многом благодаря использованию различных штаммов дрожжей рода Brettanomyces.

Бретты в брожении

При производстве большинства сортов пива и вина, присутствие дрожжей Brettanomyces не желательно, и считается признаком порчи, так как придает не специфический вкусо-ароматический профиль.

Не спорообразующий род дрожжей Brettanomyces принадлежит семейству Saccharamycetaceae. Клетки этого рода имеют разнообразную форму: овальную, иногда со стрельчато-заостренными концами, сильно удлиненные, палочковидной формы, чаще соединенные по 2 или больше. Размеры клеток значительно меньше, чем у пивных дрожжей, поэтому могут легко проникать в труднодоступные для мойки трещины в оборудовании и служить источником контаминации пива. По этой причине рекомендуется выделять отдельные емкости или цех, чтобы не произошло заражение основного производства. Почкование двусторонее и множественное. Род дрожжей Brettanomyces является предметом многочисленных исследований, но большинство из них направленны на развитие винной промышленности, так как они представляют определенную угрозу в виноделии.

Самое раннее упоминание было в докладе, сделанном Клауссеном в 1904 году. Он описал открытие новых дрожжей, и предложил назвать их Brettanomyces. Также он предположил, что эти дрожжи участвуют в дображивании и развитии характерных вкусов и ароматов в лучших английских старых элях. Первое систематическое исследование проводилось Кастером, в 1940г он представил свои результаты в виде 17 штаммов Brettanomyces, которые, по его мнению, могут быть найдены в некоторых сортах английского и бельгийского пива.

Таксономия рода Brettanomyces последние годы подвергалась многочисленным изменениям и до сих пор полностью не определена. Первоначальная классификация была основана на нескольких обнаруженных видах, размножающихся вегетативным путем (анаморфы). В последствии, была обнаружена способность размножения половым путем (телеоморфы). Современная таксономия включает пять видов в пределах рода Dekkera/ Brettanomyces. Это анаморфы Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus, Brettanomyces custersianus, Brettanomyces naardenensis, Brettanomyces nanus и телеоморфы Dekkera bruxellensis и Dekkera anomala. В 2006 году, методом секвенирования ДНК, было установлено, что между телеоморфами и анаморфами нет генетических различий. В настоящее время в пивоварении в основном используются несколько видов, Brettanomyces bruxellensis, Brettanomyces anomalus и Brettanomyces lambicus.

Brettanomyces примечательны тем, что практически полностью сбраживают экстракт, из-за чего ассоциируются с крайне сухим пивом. Но, не все штаммы способны потреблять субстрат в полной мере. Например, некоторые штаммы B.anomalus, неспособны сбраживать мальтозу, а B.claussenii, способные сбраживать лактозу и целлиобиозу до этанола. Некоторые ученые наблюдали присутствие бета-глюкозидазы, фермента ответственного за гидролиз целлиобиозы в Brettanmyces, и то, что он может присутствовать в разном количестве в различных штаммах. Этот же фермент способен гидролизовать ароматические вещества из гликозидов, представленных в пиве хмелем и фруктами, что представляет большой потенциал для получения новых необычных характеристик в пиве. Штамм B.lambicus извлеченный из классического ламбика, обладает и внутриклеточной и внеклеточной активностью альфа-глюкозидазы. Фермент альфа-глюкозидаза из B. lambicus обладает способностью гидролизовать высокомолекулярные амилодестрины, при этом оба, внеклеточный и внутриклеточный фермент, показывает схожую активность для широкого спектра углеводов. Предполагается, что эти ферменты ответственны за высокую сбраживающую способность, наблюдаемая у дрожжей Brettanomyces.

Кастером было обнаружено, что превращение глюкозы в этанол происходит быстрее в аэробных условиях, нежели в анаэробных, этот феномен он назвал "отрицательный эффект Пастера". Так же, им было обнаружено образование значительного количества уксусной кислоты при аэробном брожении, в то время как при анаэробном никаких значительных количеств не наблюдалось. Дальнейшие исследования показали, что клетки медленнее адаптируются к анаэробным условиям.

Присутсвие отрицательного эффекта Пастера чаще наблюдается в молодых клетках Brettanomyces всех видов. Термин "эффект Кастера" был позже введен Шефферсом и Викеном для описания отрицательного эффекта Пастера в видах Brettanomyces, и далее термин был подробно изложен Шефферсом и Миссетом в 1974, они предположили что эффект Кастера происходит в результате изменения NAD+ в NADH, из-за окислительной реакции, вызывающей образование уксусной кислоты. Позднее было обнаружено, что эффект Кастера связан с формированием уксусной кислоты через окисление ацетальдегида. Эффект Кастера лучше всего объясняется переходом клеток из аэробного состояния в анаэробное, в этот период гликолиз временно статичен, на это указывает отсутствие потребления глюкозы и производства CO2. Когда клетки Brettanomyces попадают в анаэробную среду, наблюдается переходная фаза задержки до десяти часов, перед возобновлением потребления глюкозы и последующим производством CO2. Механизм, отвечающий за медленную адаптацию метаболизма до конца не изучен.

Фаза задержки и последующий эффект Кастера происходит из-за продолжающегося расхода NAD+ посредством необратимого преобразования ацетальдегида в уксусную кислоту, останавливая гликолиз из-за нехватки NAD+. Эффект Кастера наблюдаемый в Brettanomyces был вызван неспособностью клеток восстанавливать окислительно-восстановительный баланс посредством меньшего производства метаболитов, особенно глицерина. Есть вероятность, что это связано с недостатком фермента глицерин 3-фосфат фосфатазы. В других видах дрожжей производство глицерина важно для усваивания NADH и восстановлении окислительно-восстановительного баланса во время анаэробного брожения.

Известно, что у глицерина продуцированного дрожжами, есть вторичная роль в усилении восприятия тела и полноты вкуса в пиве (1-2г/л). Пиво, сброженное чистой культурой Brettanomyces зачастую бывает с недостатком тела и полноты вкуса, это связано с недостатком глицерина, продуцированного во время брожения. Повышенное количество продуцированного глицерина у некоторых штаммов, указывает на более высокую скорость восстановления окислительно-восстановительного баланса. Эти штаммы, вероятно, будут способны к более полному сброжению сахаров за меньшее время.

Для наращивания биомассы дрожжей Dekkera/Brettanomyces требуется меньшее количество кислорода. Размножение начинается только на пятые сутки, после внесения в сусло. Количество этанола и уксусной кислоты, производимых в аэробных условиях, зависит от уровня аэрации. Большая концетрация кислорода замедляет темпы роста. Количество продуцируемой уксусной кислоты сильно различается у разных штаммов. Так же на рост биомассы значительно влияет температура, более высокие температуры уменьшают время, требуемое для достижения максимальной концентрации клеток, оптимальная температура наблюдается между 25°С и 32° С. Увеличение температуры выше 32°С изменяет скорость, с которой продуцируются продукты метаболизма, но не изменяет их количество.

Всем известна способность дрожжей Brettanomyces влиять на вкус и аромат пива, но характерные компоненты, продуцируемые во время брожения чистой культуры относительно плохо изучены.

Органолептика, чаще всего описывается терминами – гвоздика, пряности, лошадиная попона, навоз, дымность, медицинский запах, лейкопластырь, металл, печенье, козий запах, цветы, тропические фрукты и цитрус. Недавние исследования показали, что некоторые вещества образуются из компонентов сырья. Летучие фенольные вещества отвечают за большинство распознаваемых ароматических характеристик ассоциируемых с Brettanomyces. Методом газовой хроматографии было обнаружено, что пряные, гвоздичные и дымные ароматы соответствуют по времени задержания (улавливания) 4-этилгваяколю и 4-этилфенолу, соответственно. В областях хроматограммы где пряный аромат пропадает, часто проявляется яблочно-сидровый аромат. Гидроксикоричная кислота, парааминобензойная кислота и феруловая кислота метаболизируются Brettanomyces с образованием 4-винилфенол, 4-винилгвякол, 4-этилфенол и 4-этилгваякол. При этом, способность продуцировать 4-этилфенольные вещества (присущие баварскому пшеничному пиву) увеличивается в условиях с небольшим остаточным сахаром во время позднего процесса созревания. Недавно были идентифицированы два фермента, ответственные за фенольные ароматы Brettanomyces. Первое – это декарбоксилаза, ответственная за декарбоксилирование гидроксикоричной кислоты в 4-винил производные, второе - это винилфенолредуктаза ответственная за превращение 4-винил производных в 4-этил производные. Две формы тетрагидропиридина, 2-этилтетрагидропиридин и 2-ацетил-3,4,5,6 -тетрагидропиридин могут быть продуцированы дрожжами рода Brettanomyces. Их метаболизм включает аминокислоту L-лизин и этанол, а наличие кислорода стимулирует их образование. Эстеразы присутствующие в Brettanomyces могут реагировать с эфирами, наряду с наблюдаемой способностью этих дрожжей накапливать высокие концентрации C8-C12 жирных кислот. В ламбиках жирные кислоты этерефицируются до этиловых эфиров. В это этот период Brettanomyces являются наиболее активными дрожжами. Дальнейший анализ подтвердил отвественность эстераз за образование этилацетата, этиллактата и феноэтилацетата, наряду с гидролизом изоамилацетата. Эти сложные эфиры представляют типичные ароматы и вкусы ламбиков и образуются благодаря дрожжам Brettanomyces во время смешанного и бактериального брожения. Во время брожения чистой культуры Brettanomyces присутствует меньше уксусной и молочной кислоты поэтому, эфирная фракция менее выражена, нежели во время смешанного микробного брожения.